來源：《華西口腔醫(yī)學(xué)雜志》2019年6月第37卷第3期
作者：沈鑫1 姚羽菲1 李繼遙2 李燕1
作者單位：1.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，成都 610041；2.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙體牙髓科，成都 610041
[摘要] 真菌組在人體微生物組中所占比例不到1%，但真菌群落在人體健康與疾病狀態(tài)中扮演著關(guān)鍵角色。近年來隨著高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人體不同部位如口腔、肺部、消化道、陰道以及皮膚真菌組的結(jié)構(gòu)和組成被解析，其在人體健康和疾病中的重要地位也被挖掘。同時，人體真菌組對細菌組的組成也有影響，是維持微生物組結(jié)構(gòu)和代謝功能穩(wěn)定的關(guān)鍵物種；真菌組對宿主的免疫應(yīng)答作用也對某些疾病的發(fā)生發(fā)展有顯著影響。本文綜述了人體不同部位健康與疾病狀態(tài)下真菌組組成情況以及真菌組與細菌組、宿主免疫的相互作用。
[關(guān)鍵詞] 真菌組；疾??；細菌組；相互作用；宿主免疫反應(yīng)
人體攜帶了數(shù)十億的微生物，這些與人類共存但在特定條件下可以導(dǎo)致各種疾病的微生物（包括細菌、真菌、古細菌和病毒等）遺傳信息的總和叫做人體微生物組，它們在揭示人體健康疾病狀態(tài)方面有重要意義[1]。自2007年NIH開展人類微生物組計劃（human microbiomeproject，HMP）以來，已經(jīng)有了許多對人體細菌組學(xué)領(lǐng)域的研究，但對真菌組學(xué)的研究相對較少。真菌組在人體微生物組中所占比例很少，不到1%[2-3]，這是研究過程中的主要障礙，除此之外，真菌種屬鑒定分子分類工具的缺乏、基因數(shù)據(jù)庫不完善以及大部分真菌尚不能培養(yǎng)也使人體真菌組學(xué)的研究發(fā)展面臨巨大挑戰(zhàn)。但真菌組在人體健康與疾病狀態(tài)中扮演著關(guān)鍵角色，在維持微生物群落的結(jié)構(gòu)和代謝功能中有不可取代的地位，其通過與細菌組相互作用、參與宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而調(diào)控炎癥反應(yīng)的程度[4]，影響人體健康疾病狀態(tài)。尤其對于一些免疫缺陷綜合征、器官移植和癌癥化療的患者，由于免疫系統(tǒng)受到抑制更易遭受真菌感染，感染死亡率高達35%~45%[5]。近年來隨著高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人體不同部位如口腔、肺部、消化道、陰道以及皮膚真菌組的結(jié)構(gòu)和組成被解析，其在人體健康和疾病中的重要地位也被挖掘。同時，人體真菌組對細菌組的組成也有影響，是維持微生物組結(jié)構(gòu)和代謝功能穩(wěn)定的關(guān)鍵物種；真菌組對宿主的免疫應(yīng)答作用也對某些疾病的發(fā)生發(fā)展有顯著影響。本文綜述了人體不同部位健康與疾病狀態(tài)下真菌組組成情況以及真菌組與細菌組、宿主免疫的相互作用。
1、口腔真菌組
口腔是微生物群落在人體寄居的重要窗口之一，由于其解剖位置的特殊性，口腔微生物對口腔以及全身健康狀態(tài)的維持都有至關(guān)重要的作用?？谇恢屑s有700多種細菌，口腔常見疾病如齲病、牙齦炎、牙周炎等都與細菌組之間有密切聯(lián)系。相比于細菌組，口腔真菌組與口腔健康和疾病之間的關(guān)系探討較少。研究[6-7]表明，口腔真菌組大約超過50%都屬于子囊菌門，其次是擔(dān)子菌門、結(jié)合菌門、壺菌門、球囊菌門等?？谇痪哂卸鄠€微生態(tài)環(huán)境完全不同的生態(tài)位點，研究所取樣本的位點不同以及對真菌組測序的序列不同，往往會檢測到不同的真菌屬。Ghannoum等[6]對20例健康人群口腔含漱液中的真菌組進行ITS區(qū)域測序，首次報道了健康人群口腔中真菌組的多樣性構(gòu)成情況，并對健康人群核心口腔真菌組（檢出率大于20%）進行了定義。他們共檢測出了可培養(yǎng)的真菌屬74個、不可培養(yǎng)真菌屬11個，其中念珠菌屬檢出率最高，其次是枝孢屬、短梗霉屬、酵母屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、隱球菌屬。隨后，Dupuy等[7]對健康人群的唾液樣本進行真菌ITS1區(qū)域測序發(fā)現(xiàn)，唾液樣本中除了上述研究檢出的真菌屬，還有一種皮膚的常駐真菌屬馬拉色菌的檢出率也很高（13%~96%）。該研究首次在口腔中檢測出了馬拉色菌屬，重新定義了健康人群核心口腔真菌組。最近，本課題組對18名健康人群唾液樣本真菌組ITS2區(qū)域進行Illumina MiSeq測序，共檢測出280個真菌屬，其中念珠菌屬、酵母屬、子囊菌門未鑒定屬、酵母目未鑒定屬、被孢菌屬、毛孢子菌屬、青霉屬、木霉屬這8個真菌屬的豐度都在1%以上，同時也檢測到馬拉色菌屬的存在。隨著真菌組測序技術(shù)的進步和分子分類工具的完善，將有更多以前未被鑒別定義的口腔真菌種屬為大家所了解，為更好地解釋口腔真菌組與人體健康疾病的關(guān)系打好基礎(chǔ)。
口腔微生物群落穩(wěn)定狀態(tài)的維持有助于口腔健康，口腔微生物組菌群的失調(diào)與炎癥性疾病的發(fā)生有關(guān)，其中真菌群落的失調(diào)對宿主免疫也有不利作用，不同疾病狀態(tài)下口腔真菌組的結(jié)構(gòu)組成也會發(fā)生變化?？谇荒钪榫』颊吲c健康人群相比，真菌組在屬的水平上都以念珠菌屬為主，但在種的水平上存在差異，口腔念珠菌病患者非白色念珠菌如都柏林念珠菌明顯高于健康人群，提示非白念珠菌與口腔念珠菌病的發(fā)生也有一定的關(guān)聯(lián)性[8]。本課題組對扁平苔蘚患者唾液樣本研究發(fā)現(xiàn)，念珠菌屬和曲霉菌屬的豐度和檢出率都顯著升高。Persoon等[9]在根尖周炎患牙根尖組織中檢測發(fā)現(xiàn)念珠菌屬和馬拉色菌屬檢測率較高。當(dāng)機體免疫功能缺陷或受到抑制時，口腔環(huán)境更易發(fā)生真菌菌群失調(diào)。人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染和糖尿病患者口腔中念珠菌屬多處于過度生長的狀態(tài)，常伴發(fā)口腔念珠菌病。Mukherjee等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HIV感染人群含漱液樣本中細菌組構(gòu)成無明顯改變，但真菌組構(gòu)成卻并不相同：念珠菌屬、附球菌屬、鏈格孢屬在HIV感染患者中檢出率較高（大于20%），而健康人檢出率最高的依次是念珠菌屬、畢赤酵母屬、鐮刀菌屬。目前關(guān)于不同疾病狀態(tài)下口腔真菌組失調(diào)的研究多局限于不同真菌屬之間豐度與檢出率的變化，缺乏對其發(fā)生機制的探討，主要原因在于大部分真菌屬難以用培養(yǎng)分離的方式對其進行驗證。
口腔環(huán)境中微生物群落的穩(wěn)定主要通過菌群之間的相互作用來維持。真菌組與細菌組之間主要通過物理性黏附、共聚和群體感應(yīng)以及真菌與細菌的代謝產(chǎn)物等3個途徑來實現(xiàn)相互協(xié)同共生或者相互拮抗，調(diào)節(jié)菌群之間的平衡，維持機體的健康狀態(tài)?？谇恢卸喾N微生物可形成互養(yǎng)集團共生，比如念珠菌屬、普雷沃菌、瘤胃球菌和甲烷短桿菌之間具有協(xié)同作用。念珠菌屬可代謝復(fù)雜的碳水化合物，而普雷沃菌和瘤胃球菌可發(fā)酵念珠菌產(chǎn)生的單糖，甲烷短桿菌能使用這些細菌發(fā)酵的產(chǎn)物從而產(chǎn)生甲烷和二氧化碳[3]。戈登鏈球菌產(chǎn)生的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶對白色念珠菌也有協(xié)同作用，促進生物膜的形成[11]。牙齒硬組織的體外研究[12]發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌與金黃色葡萄球菌之間存在協(xié)同作用，念珠菌屬與細菌發(fā)生共聚黏附后形成“玉米棒子”樣的結(jié)構(gòu)，充當(dāng)“連接橋”的作用，可以減弱唾液對細菌的沖刷作用。此外，金黃色葡萄球菌黏附在白色念珠菌上時使其對抗菌藥物的易感性下降[13]，更容易產(chǎn)生耐藥。口腔真菌組與細菌組之間還存在拮抗作用。Mukherjee等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HIV患者口腔中畢赤酵母屬與念珠菌屬存在負相關(guān)關(guān)系，畢赤酵母屬可以抑制念珠菌屬菌絲的形成。Hogan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌生長密度過大時會產(chǎn)生一種信號分子，使白色念珠菌從菌絲態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榻湍笐B(tài)，導(dǎo)致假銅綠單胞菌不能黏附在其菌絲上，同時也降低了白色念珠菌的毒力。念珠菌屬和鏈球菌屬之間也有類似相互作用，變異鏈球菌產(chǎn)生的感受態(tài)刺激因子在早期可以抑制白色念珠菌從酵母態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫z態(tài)，從而影響白色念珠菌的毒力[15]。但白色念珠菌可以利用變異鏈球菌產(chǎn)生的乳酸鹽作為維持其生長的碳源，因此白色念珠菌與變異鏈球菌二者之間的關(guān)系還有待商榷。
2、肺部真菌組
人體呼吸系統(tǒng)暴露在一個大約每立方空氣中就有5萬個真菌孢子的環(huán)境之中，對于一些長期抗菌治療或者免疫功能受到抑制的患者，真菌在肺部的定植常作為引起全身性真菌感染的首要窗口。在過去很長一段時期研究者認為肺部在健康狀態(tài)下處于無菌的狀態(tài)，只有疾病發(fā)生時微生物才會在肺部定植。分子分類鑒別比對基因庫的缺乏和取材過程中容易受到口腔和上呼吸道菌群的污染等原因也阻礙了肺部真菌組研究的發(fā)展[16]。但最新研究表明健康人群肺部并不是無菌的，大部分定植在肺部的真菌多是通過呼吸作用從外界環(huán)境中吸入或者口腔中的真菌遷移而來，所以真菌組在個體間差異較大但豐度較低，菌群極不穩(wěn)定。Tipton等[17]研究認為，人體健康狀態(tài)下肺部與外界環(huán)境之中存在的真菌屬具有較高的相似性，最常見的真菌屬是小戴衛(wèi)霉菌屬、枝孢屬、散囊菌屬、青霉菌屬和曲霉屬等。但當(dāng)肺的生理狀態(tài)改變時（如疾病狀態(tài)下），真菌組多樣性下降，群落構(gòu)成穩(wěn)定性變高。例如大部分囊性纖維化患者的肺部真菌組以念珠菌屬、曲霉菌屬、馬拉色菌屬為主，且隨著疾病程度的加重，真菌組多樣性減小[18]。肺移植患者的肺部真菌組成與健康人群相比，多樣性也呈下降趨勢，但某些真菌如念珠菌屬豐度卻是增加的[19]。根據(jù)肺部生理狀態(tài)改變伴隨真菌組穩(wěn)定性變化這一規(guī)律，在臨床工作中用高通量測序的方法檢測肺部真菌組多樣性的變化，可以用來評估患者肺部功能的變化以便于指導(dǎo)臨床治療。
3、消化道真菌組
人體消化道真菌組約占整個微生物組的0.1%[3]，主要伴隨食物進入消化道，在黏膜上定植成為常駐菌群或者隨糞便排泄出去，大部分屬于子囊菌門、擔(dān)子菌門和接合菌門[20-25]。不同的飲食攝入類型可對消化道的真菌組多樣性產(chǎn)生影響。高蛋白飲食人群青霉菌屬的豐度明顯增加，而以植物性飲食為主的人群則以念珠菌屬的豐度相對較高[25]。由于消化道涉及多個不同微環(huán)境的部位，所以機體在健康狀態(tài)下不同部位之間真菌組差異較大。胃液樣本中可以檢測到念珠菌屬和單胞瓶霉屬，因為其具有耐受低pH值的環(huán)境的特性[20]。小腸黏膜由于樣本取材比較困難，該部位真菌組的多樣性研究較少。Ott等[21]用活檢取材的方法，發(fā)現(xiàn)在人體結(jié)腸黏膜中檢出率最高的依次是座囊霉屬、溶磷白地霉和黑粉菌屬。Hamad等[22]從健康人群的糞便樣本中發(fā)現(xiàn)了27種真菌，其中溶磷白地霉檢出率最高。Hoffmann等[23]從健康人群的糞便中檢測出了66個真菌屬、184個真菌種，其中酵母屬檢出率最高，其次是念珠菌屬和枝孢菌屬。Mar Rodríguez等[24]從健康人群的糞便中檢測出了75個真菌屬，檢出率最高的依次是毛霉屬、念珠菌屬、青霉菌屬和酵母屬、曲霉菌屬。以上研究可以發(fā)現(xiàn)腸道真菌組的多樣性和高度變化，由于大部分研究取樣均為糞便標(biāo)本，該樣本包括了許多一過性的真菌種屬，因此用糞便樣本來分析真菌組多樣性并不能完全代表消化道實際的真菌組構(gòu)成情況。目前對人體健康狀態(tài)下消化道真菌組的多樣性尚未有共識，但腸道黏膜取材的樣本檢測出來的真菌組穩(wěn)定性相比于糞便標(biāo)本更高一些[26]。
消化道真菌群的多樣性和穩(wěn)定性的改變與機體健康疾病狀態(tài)密切相關(guān)，比如一些炎性腸病患者如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，與健康人群相比，腸道中擔(dān)子菌門/子囊菌門的比例增加，釀酒酵母菌的比例降低，白色念珠菌的比例增加[27]。肥胖人群的腸道真菌組與健康人群相比在科的水平上真菌組多樣性明顯下降，其中毛霉菌屬是健康人群中的優(yōu)勢菌而在肥胖人群中檢出率很低，提示該真菌屬可能與體重的減輕相關(guān)[26]。
真菌組在腸道的定植也受到細菌組的調(diào)控。在炎性腸病中，大腸埃希菌、黏質(zhì)沙雷菌和熱帶念珠菌三者之間有協(xié)同作用[27]，三者在腸道局部形成一層菌膜，介導(dǎo)炎癥的發(fā)生。熱帶念珠菌的菌絲可以破壞腸黏膜組織，激發(fā)免疫應(yīng)答，黏質(zhì)沙雷菌能在大腸埃希菌和真菌之間形成交聯(lián)橋，大腸埃希菌和黏質(zhì)雷氏菌的脂多糖又可以促進菌膜的成熟，因此這層生物膜使微生物可以抵抗免疫細胞的攻擊，體外研究也證實了這一點，發(fā)現(xiàn)三者形成的生物膜均顯著大于單物種和雙物種生物膜。腸道真菌組與細菌組之間也存在競爭拮抗作用。小鼠實驗發(fā)現(xiàn)短期抗生素的使用使腸道細菌組多樣性下降而念珠菌屬的豐度增加[28]。白色念珠菌在小鼠腸道定植后腸道細菌擬桿菌門和互養(yǎng)菌門的比例下降而厚壁菌門沒有明顯的變化，但白色念珠菌引起腸道細菌組的變化是否是一過性的變化以及如何作用于宿主還有待進一步研究[29]。
4、陰道真菌組
陰道是一個真菌群落比較豐富的環(huán)境，其中超過50%的真菌組屬于子囊菌門，主要是酵母目，最常見的是念珠菌屬，其次是枝孢屬、散囊菌屬、鏈格孢屬和紅酵母屬，還有一部分屬于未鑒別的真菌屬[30-32]。真菌在陰道的定植生長受到機體免疫防御系統(tǒng)和其他微生物種類的共同影響。陰道真菌組多樣性的變化與妊娠、抗生素的使用、HIV感染、糖尿病、復(fù)發(fā)性外陰陰道念珠菌病的發(fā)生均有一定的關(guān)聯(lián)性[33-34]。妊娠期間陰道黏膜上皮由于雌激素水平和糖原生成增高，念珠菌屬可達到總菌群的40%，臨床研究的證據(jù)表明母親陰道念珠菌比例的增加可能與早產(chǎn)兒的發(fā)生有一定的聯(lián)系，但具體機制還未得到證實[35]。乳酸桿菌在健康人群的陰道中是優(yōu)勢菌，其產(chǎn)生一些乳酸有利于陰道維持一個酸性環(huán)境，從而抑制真菌的生長，還可以和念珠菌屬競爭與黏膜上皮細胞結(jié)合位點[35]，從而減少念珠菌在陰道的定植，維持微生物群落的穩(wěn)定?？股氐氖褂檬谷樗釛U菌的數(shù)量下降而念珠菌屬得以大量生長，更容易患陰道念珠菌病。
5、皮膚真菌組
相比于人體其他部位，皮膚具有溫度較低、較干燥，含有大量脂質(zhì)和蛋白（如角蛋白）的特性，為一些親脂性的真菌屬如馬拉色菌屬提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[36-37]，有利于這些菌在皮膚的定植，成為優(yōu)勢菌屬。Findley等[36]對健康人不同皮膚部位進行測序，明確了皮膚上正常真菌組的多樣性，為研究真菌性皮膚病打下了基礎(chǔ)。該研究發(fā)現(xiàn)不同的皮膚部位真菌群落構(gòu)成不同，頭部和軀干上馬拉色菌屬是主要的優(yōu)勢菌，其中頭皮、前額多為球形馬拉色菌，后背多為限制性馬拉色菌。手部真菌含量較少，與之相反的是足部真菌多樣性較高（40~80個真菌屬），除了馬拉色菌屬還檢測到紅酵母屬、德巴利酵母屬、隱球菌屬和念珠菌屬等真菌屬，但隨時間的推移真菌群落的穩(wěn)定性下降，其原因可能與足部頻繁地與外界環(huán)境接觸有關(guān)。馬拉色菌屬是皮膚上的常駐菌，與角質(zhì)形成細胞、免疫細胞的相互作用使得這種共生關(guān)系轉(zhuǎn)化為致病關(guān)系，轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏顟B(tài)的機制尚不清楚，可能與其產(chǎn)生或者分泌刺激性脂肪酸導(dǎo)致皮膚過度增殖和產(chǎn)生鱗屑有關(guān)[38]。頭皮的脂溢性皮炎也稱為頭皮屑，主要就是由限制性馬拉色菌和球形馬拉色菌引起。當(dāng)皮膚的完整性受到破壞時，比如糖尿病患者足部形成潰瘍后，致病性真菌在創(chuàng)口表面定植的速度較快，往往加重病情。大約80%的患者足部可檢測到真菌，包括子囊菌門和擔(dān)子菌門里的17種真菌種（檢出率均大于1%），其中臘葉芽枝霉和白色念珠菌的檢出率較高，推測其有助于慢性感染的加重[39]。皮膚上的真菌和細菌也存在一些相互作用，比如在足部，放線菌門和子囊菌門、擔(dān)子菌門在豐度上呈負相關(guān)關(guān)系，具體機制還不是很清楚[37]。
6、真菌感染與宿主抗真菌免疫反應(yīng)
機體免疫力下降或者免疫功能受到抑制時，口腔、肺部、消化道、陰道和皮膚等部位更容易發(fā)生真菌菌群的失調(diào)和真菌感染。當(dāng)念珠菌屬、馬拉色菌屬、曲霉屬等真菌感染時，體內(nèi)的上皮細胞和固有免疫細胞如吞噬細胞和樹突狀細胞通過不同的受體分子來識別和處理真菌的表面抗原成分，通過不同途徑共同作用抵抗真菌的感染。其中樹突狀細胞相關(guān)性C型植物血凝素-1（C-type lectin domain family 7 member A，Dectin-1）在固有免疫細胞吞噬和殺滅真菌中具有重要作用[40]，可以特異性地識別念珠菌屬、曲霉等真菌細胞壁的β-1,3-葡聚糖，介導(dǎo)細胞因子的產(chǎn)生從而影響T細胞的分化，實現(xiàn)宿主抗真菌免疫反應(yīng)的作用。動物研究發(fā)現(xiàn)，該受體分子具有抗全身性念珠菌病感染作用，并且在很多部位如口腔黏膜[41]、肺部[42]、皮膚[43]等都具有調(diào)控作用。真菌感染時，上皮遭到破壞，大量的中性粒細胞和單核細胞浸潤，產(chǎn)生炎性細胞因子并募集更多的固有免疫細胞和適應(yīng)性免疫細胞，后者主要是輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17），共同參與抗真菌免疫反應(yīng)。浸潤的中性粒細胞還可以通過釋放大量的活性氧來直接殺滅真菌。受感染的上皮細胞可以產(chǎn)生抗菌肽來影響真菌在宿主表面的存活。另外研究[44]發(fā)現(xiàn)，Th17免疫細胞的缺陷與口腔中念珠菌屬的過度生長有緊密的聯(lián)系，提示Th17細胞在抗真菌免疫中有重要作用。3型固有淋巴細胞（innate lym-phoid cell 3，ILC3）也可直接與真菌作用或者通過其他免疫細胞產(chǎn)生的白細胞介素（interleukin，IL）2和17來發(fā)揮抗真菌作用。
綜上，本文探討了近年來人體不同腔道黏膜表面在健康和不同疾病狀態(tài)下真菌組的構(gòu)成和多樣性的改變、真菌組與細菌組通過相互作用維持或改變微生物群落的穩(wěn)定、宿主抗真菌免疫反應(yīng)的主要途徑等方面的研究進展，為進一步明確真菌組與人體疾病的關(guān)系提供了方向。隨著高通量測序技術(shù)的快速進展，人們對人體各部位真菌群落的組成和多樣性研究均取得了一定的進展，但是對真菌組的功能組學(xué)及其在人類健康和疾病中的具體作用機制還知之甚少，這是今后的研究中值得探討的部分。
[參考文獻]（略）
詳見《華西口腔醫(yī)學(xué)雜志》2019年6月第37卷第3期
